1.由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。所以細胞株篩選時不能太早;但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之后才開始加篩選。隨著細胞的代謝，濃度和活性都會下降，所以每3-5天都要更換一次篩選液。

　　2.加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經得到表達。一般是轉染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是穩定細胞株篩選濃度的1/2。

　　關于維持濃度，有人說細胞會出現對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。而且如果要挑選幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。

　　此外，也需穩定細胞系構建培養液：

　　加藥篩選穩定細胞株約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞*。這時會出現：

　　1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有表達陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液。

　　2.孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液，再轉染后篩選穩轉細胞株過程中就可以應用這種培養基。

　　3.適當增加血清濃度。

>> 返回首頁